VALIDAÇÃO DO TESTE COMETA EM CÉLULAS DA MUCOSA BUCAL

Resumo

O dano ao DNA está intimamente associado ao surgimento de cânceres e doenças crônicas, sendo que as formas de observar essas alterações são a análise da presença de micronúcleos nas células e alterações no conteúdo de DNA no núcleo. Dessa forma, este projeto propõe utilizar o teste cometa em células da mucosa bucal de agricultores para identificar os níveis de genotoxicidade dos agrotóxicos, já que o teste cometa registra o rastro de DNA danificado presente nos núcleos, levando em conta que o primeiro contato com agentes externos se dá nas células bucais sendo então o primeiro local a manifestar alterações. Porém, para utilizá-lo em células da mucosa, é necessário a adaptação de um protocolo de análise já existente que utiliza células sanguíneas. A proposta tem por objetivo facilitar a coleta de material para a análise, levando em consideração que o protocolo com células sanguíneas necessita que o indivíduo se dirija até um laboratório para a coleta, enquanto a coleta de células da mucosa bucal pode ser feita diretamente pelo pesquisador utilizando uma escova estéril. Entretanto, a adaptação desse protocolo enfrenta alguns desafios, pois as características biológicas das células da mucosa bucal e das células sanguíneas são diferentes. Naturalmente, as células sanguíneas tendem a manter-se separadas e as células da mucosa bucal têm alto nível de adesão celular, o que dificulta a separação das células durante o processo de confecção das lâminas. Outra característica é que, no protocolo com células sanguíneas, o número de células para análise é baixo, já que são utilizados apenas os glóbulos brancos. No entanto, todas as células coletadas da mucosa bucal são usadas e viáveis, sendo necessárias diluições para estabelecer um padrão de volume de células por µL de amostra, de forma que cada lâmina apresente em torno de 50 células, pois um número maior acarreta a sobreposição de células, inviabilizando a contagem. Para a preparação das lâminas, é necessária a coleta das células e o armazenamento em um fixador. Posteriormente, as células passam por um processo de centrifugação e lavagem para a retirada de impurezas presentes na amostra. Logo em seguida, as células passam pela lise, processo que lisa as membranas celulares, permanecendo apenas o DNA que estava no núcleo. Após isso, as células são submetidas à eletroforese, que permite a criação do “rastro do cometa” pela diferença de massa entre o núcleo intacto e os núcleos danificados. Ao final, as lâminas são coradas e analisadas em microscópio de fluorescência.